F1：QPCR 設(shè)計(jì)引物應(yīng)該注意什么？
A1：（1）擴(kuò)增產(chǎn)物推薦長度 80-200bp，越短擴(kuò)增效率越高，為了和引物二聚體做明顯區(qū)分，長度要大于80bp，太長會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增效率下降；
（2）3’端盡量避免高GC或高AT含量區(qū)域；
（3）最后一個(gè)堿基最好為G或者C，避免使用T；
（4）正反向引物的Tm值最好相差不要超過1℃；
（5）GC含量最好在40-60%；
（6）如果后續(xù)用探針法，注意探針Tm值高于引物Tm值8-10℃。
F2：cDNA模板需要稀釋嗎？應(yīng)該稀釋多少倍進(jìn)行定量？
A2：沒有具體的稀釋參考倍數(shù)，一般cDNA每稀釋10倍CT值變大3.3，可以根據(jù)這個(gè)規(guī)律進(jìn)行合適的稀釋。可以使用cDNA原液、10倍稀釋液、100倍稀釋液作為模板進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)，根據(jù)規(guī)律選擇CT值落在18-28，或者15-33范圍內(nèi)的稀釋倍數(shù)。也可以參考換試劑之前的稀釋倍數(shù)。
注：當(dāng)使用 cDNA 原液進(jìn)行檢測(cè)的時(shí)候，使用量不能超過qPCR 反應(yīng)體系的 1/10，因?yàn)?nbsp;cDNA 中包含很多抑制 qPCR 的組分，cDNA 體積大時(shí)風(fēng)險(xiǎn)很高。
F3：擴(kuò)增曲線形狀異常
A3：(1) 擴(kuò)增曲線不光滑：信號(hào)太弱，經(jīng)系統(tǒng)矯正后產(chǎn)生。建議提高模板濃度重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
(2) 擴(kuò)增曲線斷裂或下滑：一般由于模板濃度較高，基線的終點(diǎn)值大于CT值。建議減小基線終點(diǎn)（CT值-4），重新分析數(shù)據(jù)。
(3) 個(gè)別擴(kuò)增曲線突然驟降：反應(yīng)管內(nèi)留有氣泡，由于溫度升高后氣泡破裂，使儀器檢測(cè)到的熒光值突然降低所致。建議反應(yīng)前要仔細(xì)檢查反應(yīng)管內(nèi)是否有氣泡殘留。
(4) 擴(kuò)增曲線呈鋸齒狀且不連續(xù)：ROX添加不當(dāng)。需校正參比染料。
F4:標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增小于90%或者大于120%，線性關(guān)系不佳
A4：（1）加樣誤差。加大模板稀釋倍數(shù)，提高加樣體積，使用不同稀釋梯度的濃度更準(zhǔn)確；
（2）標(biāo)準(zhǔn)品降解，重新制備標(biāo)準(zhǔn)品，重復(fù)實(shí)驗(yàn)；
（3）模板濃度過高，存在抑制反應(yīng)，增加模板稀釋倍數(shù)；
（4）引物擴(kuò)增特異性不好，重新設(shè)計(jì)引物重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
F5：反應(yīng)結(jié)束無擴(kuò)增曲線出現(xiàn)
A5：⑴ 反應(yīng)循環(huán)數(shù)不夠：一般設(shè)置循環(huán)數(shù)為40，但需要注意的是過多的循環(huán)會(huì)增加過多的背景信號(hào)，降低數(shù)據(jù)可信度。
⑵ 確認(rèn)程序中是否設(shè)置了信號(hào)采集步驟：兩步法擴(kuò)增程序一般將信號(hào)采集設(shè)置在退火延伸階段；三步法擴(kuò)增程序應(yīng)當(dāng)將信號(hào)采集設(shè)置在72℃ 延伸階段。
⑶ 引物不合適：重新設(shè)計(jì)引物；確認(rèn)引物是否降解：長時(shí)間未用的引物應(yīng)先通過PAGE電泳檢測(cè)完整性，以排除其降解的可能。
⑷ 模板濃度太低：減少稀釋度重復(fù)實(shí)驗(yàn)，一般未知濃度的樣品先從最高濃度做起。
⑸ 模板降解：重新制備模板，重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
F6:CT值的有效性判斷
A6: (1) 融解曲線單峰（染料法）
(2) 擴(kuò)增曲線指數(shù)擴(kuò)增區(qū)域，復(fù)孔間CT值STD<0.2
(3) 閾值設(shè)置合理
(4) NTC確認(rèn)無氣溶膠污染或可以忽略
(5) NRT確認(rèn)無基因組殘留污染或可以忽略
(6) 擴(kuò)增效率符合近似計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2大于0.98，擴(kuò)增效率e介于95-105%或者90-120%之間。
F7：CT值出現(xiàn)太晚。
A7：(1) 擴(kuò)增效率極低。優(yōu)化反應(yīng)條件，嘗試三步法擴(kuò)增程序，或者重新設(shè)計(jì)合成引物。
(2) 模板濃度太低。減少稀釋度重復(fù)實(shí)驗(yàn)，一般未知濃度的樣品先從最高濃度做起。
(3) 模板降解。重新制備模板，重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
(4) PCR產(chǎn)物太長。推薦PCR產(chǎn)物長度為80 bp-150 bp。
(5) 體系中存在PCR抑制劑。一般為模板帶入，加大模板稀釋倍數(shù)或者重新制備模板重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
F8:NTC（陰性對(duì)照）出現(xiàn)CT值，目的基因的CT值還能使用嗎？
A8：NTC出現(xiàn)擴(kuò)增一般會(huì)有兩種情況：
⑴ NTC與目的基因融解曲線峰形不重疊。一般NTC的Tm值較目的基因Tm值小。這種情況下，NTC的CT值是由引物二聚體造成的，并不影響目的基因CT值的采集。
⑵ NTC與目的基因融解曲線峰形重疊。NTC的Tm值等于目的基因的Tm值。
這種情況下，說明體系已被氣溶膠污染了。體系被污染，目的基因的CT值還能正常使用嗎？
需要計(jì)算目的基因的CT值與NTC 的CT值的差值（△CT）差值來判定。若△CT≥5/3，說明氣溶膠帶來的污染對(duì)體系影響非常小，可以忽略不計(jì)。若△CT＜5/3，說明污染比較嚴(yán)重，目的基因的CT值是不能使用的。
F9：NRT出現(xiàn)明顯擴(kuò)增
A9：NRT出現(xiàn)明顯擴(kuò)增說明有基因組污染可通過實(shí)驗(yàn)組和NRT的CT之差異來判斷實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是否可用。
當(dāng)實(shí)驗(yàn)組CT值和NRT CT值差值大于5，說明郵gDNA但值得誤差小于5%，則可以忽略；若實(shí)驗(yàn)組CT值和NRT CT值差值大于3或者幾乎一致，則實(shí)驗(yàn)組擴(kuò)增產(chǎn)物的模板很大部分來源于gDNA，這樣的實(shí)驗(yàn)組就失去定量意義，建議使用去基因組的RNA提取試劑盒進(jìn)行RNA提取，或者反轉(zhuǎn)錄時(shí)加入去基因組步驟。
F10：融解曲線出現(xiàn)多峰
A10：（1）引物設(shè)計(jì)不優(yōu)：根據(jù)設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)合成新的引物;
（2）引物濃度太高：適當(dāng)降低引物濃度;
（3）cDNA模板帶有基因組污染：重新制備cDNA模板;
（4）CT值≥30易出現(xiàn)非特異擴(kuò)增；
（5）提高退火溫度(不超過63℃）
（6）增加模板濃度：當(dāng)目的基因表達(dá)量極低時(shí)，染料法qPCR容易形成引物二聚體產(chǎn)物影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提高模板濃度。
F11:定量?jī)x器報(bào)錯(cuò)出現(xiàn)BadRox？
A11：遇到BadRox 的問題，可能出現(xiàn)的原因有：
⑴ 儀器問題：儀器需要校準(zhǔn)，ABI 儀器需要每年校準(zhǔn)一次，長時(shí)間不校準(zhǔn)，會(huì)出現(xiàn)熒光信號(hào)采集異常；儀器老化，同樣需要請(qǐng)儀器工程師進(jìn)行校準(zhǔn)或更換零部件。
⑵ 客戶體系過低，如10μl 擴(kuò)增體系，因添加體系較低而導(dǎo)致ROX總濃度偏低，易出現(xiàn)BadRox現(xiàn)象。
⑶ 試劑本身添加的ROX濃度較低，低于儀器檢測(cè)的閾值
F12：實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差
A12：（1）加樣體積失準(zhǔn)，使用準(zhǔn)確度較好的移液槍，擴(kuò)大反應(yīng)體系，將模板做高倍稀釋，以大體積加入反應(yīng)體系中；
（2）定量PCR儀不同位置溫度控制不一致。定期校準(zhǔn)儀器。
（3）模板濃度太低。模板濃度越稀，重復(fù)性越差，減少模板稀釋度或提高加樣體積。
（4）做4-6個(gè)復(fù)孔，刪除其中重復(fù)性不好的孔，將剩余的進(jìn)行后續(xù)計(jì)算。
F13：高GC含量的模板，建議用什么產(chǎn)品進(jìn)行定量？
A13：建議用Q111進(jìn)行定量
F14：如果內(nèi)參CT值很低，目的基因CT值很高，該如何稀釋樣品？
A:14：可以在定量?jī)?nèi)參的時(shí)候?qū)⒛０逑♂專磕康幕驎r(shí)模板不稀釋，結(jié)果仍舊采用 2-ΔΔCT進(jìn)行計(jì)算，CT值減兩次，稀釋倍數(shù)會(huì)被相應(yīng)減掉，但要保證不同樣品在檢測(cè)同一基因時(shí)稀釋倍數(shù)要一致。
F15：模板的稀釋液選擇。
A15：稀釋模板可以使用購買的Nuclease-free water、DEPC水或者實(shí)驗(yàn)室自備的ddH2O等。TE里有EDTA會(huì)抑制酶的活性，不可作為稀釋液。
F16:如何消除體系中的氣溶膠污染?
A16：⑴ 更換新的Mix、引物、模板。
⑵ 反應(yīng)體系盡可能在超凈臺(tái)內(nèi)操作，減少氣溶膠污染。超凈臺(tái)內(nèi)臺(tái)面需要定期使用稀釋后的84消毒液進(jìn)行擦拭，使用酒精棉球擦拭移液器，并使用紫外燈照射，以消除長期加樣造成的核酸污染。
⑶ 嚴(yán)禁在加樣房間打開qPCR產(chǎn)物的管蓋。
⑷ 使用Vazyme #R504 RNA酶和核酸清除劑。
F17：如何確定基因表達(dá)量高低。
A17：如果基因擴(kuò)增CT值超過30，使用PCR產(chǎn)物通過梯度稀釋創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，判斷該引物擴(kuò)增效率，若擴(kuò)增效率滿足90-120%，則可以判斷該基因擴(kuò)增CT值偏大是由于基因表達(dá)量低所致。
F18：復(fù)孔間重復(fù)性差？
A18：復(fù)孔間重復(fù)性差一般會(huì)有兩種情況：
情況1：CT值很大，如CT≥30，重復(fù)性差屬于正常現(xiàn)象。該現(xiàn)象符合泊松分布，即在有效模板量很少的情況下，模板與引物的碰撞存在隨機(jī)性，直接導(dǎo)致復(fù)孔間的CT值差異較大。
解決方法：如果融解曲線沒有雜峰，無模板陰性對(duì)照同目的基因的△CT值為5以上，那CT值為準(zhǔn)確的，可多設(shè)置幾個(gè)復(fù)孔，選擇重復(fù)性好的CT值參與計(jì)算。
情況2：CT值正常，如CT＜30，重復(fù)性較差。一般同操作有關(guān)。
解決辦法：從以下幾個(gè)方面進(jìn)行問題的排查：
①加樣準(zhǔn)確度；②移液器吸取液體的準(zhǔn)確度；③定期校準(zhǔn)qPCR儀。
- 加樣準(zhǔn)確度
⑴避免小體積加樣，減少加樣誤差。可以將引物、SYBR Green Mix、ddH2O配置成混合體系，并且增加模板的稀釋梯度，大體積加樣。如：原液cDNA添加1μl，可以更改為原液cDNA稀釋5倍，添加5μl，使用ddH2O補(bǔ)齊體系至20μl即可。
⑵SYBR Green Mix、配置的混合體系需要混合均勻。從-20℃冰箱拿出的試劑需要完全融化并上下顛倒徹底混勻；配置體系時(shí)，將混在一起的Mix用移液器吹打混勻。
- 移液器吸取液體的準(zhǔn)確度
⑴移液器量程定期校準(zhǔn)，校準(zhǔn)周期為1年。
⑵購買與移液器配套的槍頭，若槍頭與移液器不匹配，在吸取液體時(shí)易出現(xiàn)漏氣的現(xiàn)象，導(dǎo)致吸取量程不準(zhǔn)確。在吸取相同量程的液體體積時(shí)，注意觀察每次吸取液體在槍頭內(nèi)的液面高度是否一致。
- 定期校準(zhǔn)qPCR儀：一般qPCR儀校準(zhǔn)周期為一年。
F19：相對(duì)定量為什么要做標(biāo)準(zhǔn)曲線？
A19：相對(duì)定量分析中采用2-ΔΔCT公式進(jìn)行計(jì)算比較不同樣品中基因的表達(dá)量時(shí)，前提是該體系的擴(kuò)增效率e是盡可能接100%的。相對(duì)定量中做標(biāo)準(zhǔn)曲線的目的就是為了判斷該擴(kuò)增體系中的擴(kuò)增效率e是否是接近100%，能否用2-ΔΔCT公式進(jìn)行計(jì)算；如果擴(kuò)增效率e與100%相差很大，在比較基因表達(dá)差異時(shí)是需要帶入實(shí)際的擴(kuò)增效率進(jìn)行計(jì)算的。
F20：怎么做絕對(duì)定量？
A20：首先需要有一個(gè)已知拷貝數(shù)濃度的樣品作為標(biāo)準(zhǔn)品，將其稀釋至少5個(gè)梯度后和待測(cè)樣品同時(shí)上機(jī)進(jìn)行定量檢測(cè)，以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的Log值為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品的CT值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，將檢測(cè)獲得的待測(cè)樣品的CT值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中就能求得待測(cè)樣品的拷貝數(shù)濃度。
